本片是对日本乡村生活的迷人及节奏缓慢的描绘。故事背景设定于1958年（昭和33年），一位大学教授“草壁达郎”（草壁タツオ）和他的两个女儿“五月、梅伊”（サツキ、メイ）搬进一个森林附近的一所旧房子，而教授的妻子“草壁靖子”因染上了结核病，在附近的一所医院养病中。
搬来新家的五月和梅伊，都在家中及附近发现各种奇妙的东西，如家里藏着像是小黑球模样的“煤黑子”（ススワタリ）。而梅伊某一天也在外头发现可以将外表变不见“小龙猫”（チビトト）、为了追赶它而被引领到树洞里发现森林的守护者“大龙猫”（トトロ）；并且在一个下雨的晚上，当五月和梅伊在公车站牌边等爸爸时，她们都遇到了用树叶挡雨、先前梅伊在树洞里看到的大龙猫，不久“猫巴士”（ネコバス）来到，大龙猫给予五月一包种子后登上猫巴士离去。
之后有一天从医院得知妈妈的病情恶化，梅伊想把一个成熟的玉米带给妈妈时、不小心迷了路，当众人都遍寻不着后，五月跑去找大龙猫帮忙。之后大龙猫召唤了猫巴士，在猫巴士的帮助下，梅伊被迅速找到了，并且接送五月和梅伊穿过乡间，到医院探望她们的妈妈，最后草壁达郎在医院中得知她们的妈妈病情好转，不久就可以出院。